محیط کشت DNASE

باکتری هایی که حاوی آنزیم دی اکسی ریبو نوکلئاز باشند، هاله صورتی رنگی اطراف کلنی ها پدید می آورند. تولوئیدن آبی در حضور DNA سالم به رنگ آبی است. ولی در صورت ریختن HCL نرمال موجب تخریب مولکول DNA شده و این ترکیب به رنگ صورتی در می آید.

محیط کشت مولر هینتون آگار ((Mueller hinton agar

کاربرد اصلی این محیط جهت تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی باکتری ها (آنتی بیوگرام) به روش دیسک می باشد. بسیاری از باکتری هایی که سخت رشد Fastisious می باشند، نظیرNeisseria meningitidesN.gonorrhoeae در آن رشد می یابند.

محیط کشت فلچر ((Flecher’s medium

این محیط برای جداسازی و نگهداری لپتوسپیراها بکار می رود. پس از استریلیزه کردن و خنک نمودن محیط، به آن ۸۰ میلی لیتر سرم خرگوش استریل اضافه نموده، سپس به مقدار ۷-۵ میلی لیتر در لوله های استریل ریخته به مدت ۳۰ دقیقه در حرارت ۵۶ درجه سانتیگراد قرار می دهیم تا عامل مکمل موجود در سرم غیر فعال گردد.

برای جداسازی لپتوسپیرا، نمونه های خون-ادرار و نسج مشکوک را در این محیط کشت داده و در حرارت ۲۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ روز انکوبه می نماییم. متناوبا از کشت گسترش تهیه کرده و بوسیله میکروسکوپ با زمینه تاریک کشت را کنترل می نماییم.

در اثر تکثیر لپتوسپراها کدورت جزئی در محیط به وجود می آورند که پیدایش یک حلقه شیری رنگ در قسمت بالای محیط می تواند حاکی از رشد لپتوسپرا باشد.

محیط کشت متیل رد - وژوسپروسکار Methylred-Vegesproskaure broth) MR-VP)

این محیط ملاک آزمایشی می باشد برای تفکیک مسیرهای تخمیر گلوکز و نهایتا ایجاد ترکیبات اسیدهای آلی بوتاندیول یا بوتیلن گلایکول بوده که از این آزمایش در تفکیک و تشخیص کلی فرم ها از هم مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین در تمایز بین استافیلوکوک و میکروکوک و گونه های آن از این محیط استفاده می شود.

آزمایشMR: پس از انجام کشت و انکوباسیون ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸ ساعت، مقدار ۶/۰ میلی لیتر معرف رنگی متیل رد اضافه نموده و در صورت ظهور رنگ قرمز آزمایش MR مثبت می باشد. در صورت پیدایش رنگ نارنجی آزمایش MR مثبت ضعیف می باشد و در صورت عدم تغییر و پایداری رنگ زرد آزمایش MR منفی می باشد.

نتیجه:

ظهور رنگ قرمز: آزمایش مثبت (PH=4/4)

ظهور رنگ نارنجی: آزمایش مثبت ضعیف (PH=5/3)

ظهور رنگ زرد: آزمایش منفی (PH=5/3)

طرز تهیه معرف MR

1- متیل رد ۰۴/۰ گرم

۲- اتانول ۴۰ میلی لیتر

۳- آب مقطر ۱۰۰ میلی لیتر

متیل رد را در اتانول حل نموده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم.

آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود ۶/۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول (معرف A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس (معرف B) اضافه کرده و خوب تکان می دهیم. اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آن را به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد، آزمایش VP منفی خواهد بود.

نتیجه:

مثبت: ظهور رنگ صورتی تا قرمز

منفی: تغییر رنگی صورت نمی گیرد.

طرز تهیه معرف VP:

معرف A:

1- آلفانفتول: ۵ گرم

۲- الکل اتلیک مطلق: ۱۰۰ میلی لیتر

محلول نباید تیره تر از رنگ کاه (نی) شود. در صورت لزوم باید مجددا تقطیر گردد.

معرف B:

1- هیدروکسید پتاسیم: ۴۰ گرم

۲- آب مقطر: ۱۰۰ میلی لیتر

محیط کشت سلنیت F براث (Selenite F broth)

محیط مغذی است برای جدا سازی گونه های سالمونلاها. که یک محیط غنی کننده Enrichmentمی باشد که حاوی سلنیت سدیم است که یک نمک صفراوی است و مانع از رشد باکتری های گرم مثبت و بسیاری از باکتری های گرم منفی می گردد. میزان تکثیر سالمونلا در این محیط طی ۲۴-۱۲ ساعت اول از رشد هر یک از باکتری های روده ای سریعتر است. بنابر این کشت ثانوی باکتری در محیطهای دیگر باید ظرف همان روز (۲۴-۱۲ ساعت) انجام گردد.

باید توجه داشت این محیط در صورت ماندن و کهنه شدن خراب شده و رنگ آن به صورتی می گراید. بنابر این هرچه کم رنگتر باشد، تازه تر و برای کشت مناسبتر خواهد بود.

محیط کشت (Sulfide-Indol-Motility) SIM

با استفاده از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری ها می توان بکار برد. به طریقه Stab تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

اساس آزمایش:

مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتونهای محیط موجود است. هیدروژن سولفوره و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری های متحرک می دهد.

ایجاد هیدروژن سولفوره توسط باکتری به صورت سیاه شدن محیط ظاهر می گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروزن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس Covacs و یک میلی لیتر کلروفرم به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید ایندول توسط باکتری است. باکتری های که حاوی مجموعه آنزیم هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی سری واکنشهای شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.

حرکت باکتری بواسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود.

روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول:

فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید: ۵ گرم

ایزو آمیل الکل: ۷۵ میلی لیتر

اسید کلریدریک: ۲۵ میلی لیتر

آلدئید را در الکل به آرامی حل نموده و از بنماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده نموده و به آن اسید اضافه رده و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم. رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوه ای روشن باشد. بعضی از نمونه ها آمیل الکل کافی نیست و با آلدئید رنگ سیاه می دهد.

محیط آبگوشت حاوی ۵/۶ درصد نمک ۶٫۵% (Nacl broth)

استرپتوکوک های روده ای را که غلظت زیاد نمک را تحمل می کنند، می توان به کمک این محیط از سایر استرپتوکوک ها تشخیص داد.

تفسیر آزمایش:

از آنجا که تمام استرپتوکوک ها از تخمیر گلوکز اسید تولید می کنند در صورتی که این غلظت نمک را تحمل کنند و در این محیط رشد و تکثیر نمایند، از تخمیر گلوکز اسید تولید و محیط را به رنگ زرد در می آورند. عدم تغییر رنگ دلیل بر عدم تحمل نمک و عدم تکثیر باکتری است.

نتیجه:

ظهور رنگ زرد: مثبت

بدون تغییر رنگ: منفی

محیط کشت لیزین دکربوکسیلاز (Lysine decarboxylase broth)

این محیط توان باکتری را در دکربوکسیله نمودن اسید آمینه لیزین، تعیین می نماید. حاصل این واکنش تولید آلکالین آمین و کادوارین می باشد. به عنوان محیط تفریقی در تمایز بین آنتروباکتریاسه ها به کار برده می شود.

تفسیر آزمایش: از آنجا که همه آنتروباکتریاسه ها در نتیجه تخمیر قند گلوکز، اسید تولید نموده و محیط را به رنگ زرد در می آورند، محیط به رنگ زرد باقی خواهد ماند. مگر آنکه باکتری اسید آمینه مورد نظر را نیز دکربوکسیله کند. در این صورت قلیائیت حاصله، محیط به رنگ بنفش (قلیایی) در خواهد آمد.

نتیجه:

رنگ بنفش: مثبت

رنگ زرد: منفی

محیط کشت گزیلوز لیزین دزوکسی کولات آگار ( Xylose-lysin-decarboxycholate-agar) XLD

محیطی است انتخابی که از آنبرای جدا سازی گونه های Shigella و سایر باکتری های پاتوژن روده ای بکار می رود.

کلی فرم ها و دیگر باکتری ها یی که قادر به تخمیر یک یا هر دو قند موجود در محیط باشند، کلنی هایی به رنگ زرد پدید می آورند. (اسید) تخمیر کننده های گزیلوز که لاکتوز و سوکروز منفی هستند مانند Proteus mirabilis واکنش اسیدی خفیفی (نارنجی-کهربایی) ایجاد می کنند. گونه ها Shigellaکه عموما هیچیک از این قندها را تخمیر نمی کنند، سرتاسر محیط لوله را به حالت قلیایی (قرمز تیره) در می آورند.

گونه های Salmonella اگر چه معمولا گزیلوز مثبت هستند، ولی به واسطه برتری داشتن دکربوکسیلاسیون لیزین بر اسیدیته تخمیر گزیلوز، محیط کاملا به رنگ قرمز (قلیایی) در می آید. کلنی های همه باکتری هایی که H2S تولید می کنند، بدون توجه به اسیدیته، مرکزی سیاه دارند.

محیط کشت برد پارکرآگار (Baird parker agar)

یک محیط (Medium) انتخابی است که حاوی تلوریت پتاسیم و تلوریت لیتیم می باشد. تلوریت محیط از رشد کلی فرم ها ممانعت می نماید. استافیلوکوک اورئوس می تواند تلوریت را به تلورید تبدیل نموده و باعث ایجاد کلنی های سیاه بر روی محیط گردد. زرده ی اضافه شده به محیط نیز باعث ایجاد دو واکنش در محیط می گردد. یکی تولید لسیتینازمنجر به ناحیه کدر و دیگری تولید لیپاز که منجر به ناحیه شفاف در اطراف ناحیه کدر می شود. در انتها کلنی های مشکوک به استافیلوکوک اورئوس باید تست کواگولاز انجام گردد.

محیط کشت اسکولین براث (Esculin broth)

محیط کشت تفریقی است که در تعیین هویت عده ای از باکتری ها مانند انترو باکتریاسه، اکتینوباسیلوس ها، از آن استفاده می شود.

بعضی از باکتری ها قادرند اسکولین را که نوعی گلیکوزید می باشد، هیدرولیز کرده و آن را به گلوکز، آگلایکن و آسکولتین تبدیل نمایند. در این فرآیند آهن موجود در محیط، واکنش نشان داده و ترکیبی به رنگ قهوه ای مایل به سیاه ایجاد می نماید. بنابراین تغییر رنگ محیط از زرد شفاف به سیاه و یا قهوه ای به معنی مثبت بودن آزمایش آسکولین می باشد.

محیط کشت آبگوشت نیترات (Nitrate broth)

از این محیط می توان در تعیین توان باکتری در احیای نیترات و تبدیل آن به نیتریت و مواد احیا شده دیگر بکار برد. بسیاری از باکتری ها را می توان از این جهت مورد آزمایش قرار داد، از جمله کورینه باکتری ها، باسیلوس ها و اکتینومایست ها و …

پس از کشت باید به مدت ۴۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه نموده و پس از آن از هر یک از معرف های ذیل ۵ قطره به محیط اضافه نموده به طوریکه متوجه ظهور رنگ قرمز باشیم.

تفسیر آزمایش:

رنگ قرمز مربوط به پارا سولفور بنزن و آزونفتیل آمین می باشد، که نوعی رنگ آزو (Azo dye) است که در نتیجه دیازوتیازاسیون اسید سولفانیلیک به وسیله نیتریت و همچنین در اثر ترکیب نفتیل آمین با اتم انتهایی آزوتیازید، اسید سولفانیلیک حاصل می گردد. در صورتی که احیای نیترات از حد نیتریت هم گذشته و به مراحل تولید گاز ازت N2 یا آمونیاک۳ NH رسیده باشد، به علت عدم وجود نیتریت در محیط با افزودن معرف های ذیل تغییر رنگی ظاهر نمی شود. در حقیقت نتیجه آزمایش منفی کاذب است. به منظور تمایز منفی کاذب از منفی حقیقی، به محیط (پس از افزودن معرفها و منفی شدن) کمی پودر روی اضافه نموده، در صورتی که نیترات در محیط باقی مانده باشد یعنی باکتری آنرا به نیتریت تبدیل نکرده باشد، پودر روی، نیترات را به نیتریت احیا و رنگ قرمز ظاهر می گردد. عدم تغییر رنگ در این مرحله حاکی از عدم وجود نیترات در محیط است. این به آن معنی است که باکتری نیترات را از مرز نیتریت هم بیشتر احیا نموده و به گازهای ازت و آمونیاک تبدیل کرده است.

نتیجه پس از افزودن پودر روی:

۱- ظهور رنگ قرمز: نیترات منفی

۲- عدم تغییر رنگ: نیترات مثب